89

تشخیص زود هنگام عفونت ویروسی و اقدام برای درمان به موقع بیماری، بدون آن که نیاز به بیوپسی مغز باشد (در صورت بروز آنسفالیت ویروسی، تشخیص سریع عفونت ویروسی، برای مدیریت بیماری و شروع به موقع درمان و کاهش تلفات الزامی است).

روش مرجع: ردیابی مولکولی DNA ویروس هرپس سیمپلکس روش ارجح: ردیابی ژنوم ویروس به وسیله واکنش زنجیره ای

تشخیص HSV به روش Real-Time PCR HSV DNA Detection, Herpes Simplex Virus Detection by Real-Time PCR, R

سرم یا پلاسما، ادرار، مایعات بدن نظیر نخاعی (CSF)، آمنیوتی و چشمی، نمونه تناسلی نظیر نمونه تهیه شده

• ü 5 ml ترشحات ریوی، ادرار و خون، • ü 1ml سرم، پلاسما و مایعات بدن، • ü نمونه های تناسلی و نمونه ها

1. سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام آزمایش، در دمای ºC 20- نگهداری شود. سایر نمونه های مورد استفاده نیز باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC 20- قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود. 4. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود. 5. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در oC 20- فریز نمایید

زنجیره سرد

سن و جنس بیمار و سابقه بیماری آن را یادداشت کنید.

1. از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود. 2. برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود. 3. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد. 4. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود. 5. پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20 – نگهداری شود. 6. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود. 7. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود. 8. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

نام و نام خانوادگی سن و جنس بیمار

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل. 2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه. 3. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد. 2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

• نتیجه «Undetected» نشان می دهد که DNA ویروس در نمونه یافت نشده است. • نتایج کمی بیان شده به واحد copy/ml نشان دهنده میزان فعالیت ویروس و تکثیر آن در بیمار است. • نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HSV و یا پاسخ به درمان ضد ویروسی نظارت می کند. • تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA ویروس در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است. • در صورت عدم ردیابی DNA ویروس در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به ویروس رد نمی گردد چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسیدنوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته ‌باشد.ویروس های هرپس سیمپلکس از خانواده هرپس ویروس ها می باشند که به فراوانی در جوامع انسانی پراکنده اند. این ویروس ها، میزبان های زیادی داشته و قادرند در انواع مختلفی از سلول ها تکثیر یافته و حیوانات مختلفی را آلوده نمایند. تمام هرپس ویروس ها دارای یک هسته مرکزی از زنجیره مضاعف DNA مارپیچی هستند که با یک کپسید پروتئینی با تقارن بیست وجهی احاطه شده اند. ویروس هرپس سیمپلکس عامل عفونت های بسیار متنوعی است که معمولاً در بزرگسالان فاقد علائم بالینی واضح می باشند. پس از عفونت

هم چنان که پیشتر ذکر شد، روش های مبتنی بر کشت HSV و روش های سرولوژیکی جهت تشخیص عفونت ویروسی در بیماران چندان کارامد نبوده و این مسأله می تواند در مبتلایان به انسفالیت ویروسی عواقب جدی به همراه داشته باشد. لذا روشهای مبتنی بر PCR، به عنوان بهترین روش جهت تشخیص به موقع و انجام اقدامات درمانی مناسب شناخته شده است. ردیابی پاتوژن به وسیله PCR بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم ویروس صورت می گیرد. در حال حاضر روش Real time PCR در مقایسه با سایر روش های ارزیابی میزان ویروس دارای بیشترین حساسیت و وسیع ترین دامنه اندازه گیری است. در این روش محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود که این امر عموماً به واسطه پروب های الیگونوکلئوتیدی که به طور اختصاصی به محصول تکثیر یافته متصل می شوند، صورت می گیرد. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، محصول جمع شده را ردیابی نموده و کمیت آن را نیز تعیین نمائیم.

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند. • نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد. • فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.